預(yù)期應(yīng)用

　　ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中FETU-A含量。

實驗原理

　　人胎球蛋白A ELISA試劑盒用純化的FETU-A抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的FETU-A抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FETU-A呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

　　1、 酶標板：一塊（96孔）

　　2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5,000 ng/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成5,000 ng/ml，2,500 ng/ml，1,250 ng/ml，625 ng/ml，312 ng/ml，156 ng/ml，78 ng/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制2,500 ng/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）5,000 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

　　3、 樣品稀釋液：1×20ml。

　　4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

　　5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

　　6、檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋（如：10 檢測溶液A /990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔），實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。

　　7、檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

　　8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

　　9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

　　10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/LH2SO4）。

　　11、覆膜：5張

　　12、使用說明書：1份

自備物品

　　1、酶標儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

　　2、微量加液器及吸頭，EP管

　　3、蒸餾水或去離子水，濾紙標本的采集及保存

　　1、血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?span lang="EN-US">-20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　2、血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?span lang="EN-US">-20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　3、其它生物標本：請1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?span lang="EN-US">-20 或-80 保 存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　4、樣本處理：血清或血漿標本推薦稀釋200倍。標本使用0.02 M 的PBS稀釋（PH=7.0-7.2）。

　　注：以上標本均應(yīng)密封保存，4保存應(yīng)小于1周，-20不應(yīng)超過1個月，-80不應(yīng)超過2個月;標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟

　　實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

　　1、加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?span lang="EN-US"> 100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

　　2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100 （臨用前配制），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。

　　3、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

　　4、每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。

　　5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

　　6、每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

　　7、每孔加終止溶液50 ，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。

　　8、立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（值）。

　　注：

　　1、 試劑準備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

　　2、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。

　　3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

　　4、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。

　　5、試劑配制：Detection A及DetectionB在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

　　6、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

　　7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

洗板方法

　　1、手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次;根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

　　2、自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

　　人胎球蛋白A ELISA試劑盒可同時檢測重組或天然的人FETU-A，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

　　各標準品及樣本值扣除空白孔 值后作圖（七點圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標），值為橫坐標（對數(shù)坐標），在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品值，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

　　檢測范圍：78 ng/ml - 5,000 ng/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值：5,000 ng/ml，2,500 ng/ml，1,250 ng/ml，625 ng/ml，312 ng/ml，156 ng/ml，78 ng/ml。

　　zui低檢測限：19.5 ng/ml

說明

　　1、 由于現(xiàn)有條件及科學技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，

　　本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險。

　　2、 zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必

　　準備充足的標本備份。

　　3、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的 污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

　　4、試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20，其余試劑短期保存請置于4，長期保存則置于-20。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20，避免潮濕。

　　5、 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

　　6、剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

　　7、 有效期：6個月。

　　8、 人胎球蛋白A ELISA試劑盒操作說明適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。