免疫組化的經(jīng)驗總結(jié),主要分享操作要點與技巧

免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)）,對其進行定位、定性及定量的研究,稱為免疫組織化學.
    免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體.
操作要點和技巧
1．固定：用4%的多聚甲醛固定液.對于冰凍切片,甲醛固定有時比冰凍丙 酮好；但對于不同的組織和抗原,可選用不同的固定液.有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液,請于購置前注意說明書.
Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其對組織的穿透力較強,固定較好,結(jié)構(gòu)完整,但因偏酸,對抗原有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標本的長期保存.
PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,適于固定石蠟切片.適于富含糖類組織,對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好.
2．組織脫水,透明：時間不能太長,否則在切片時容易碎片,切不完整.
3．切片時展片：有些組織在切片后難以在水中展開,這時可適當?shù)卦谒屑尤霂椎我掖?
4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過夜,溫度太高或時間太長,抗原容易丟失.
5．蠟塊及切片的保存：在4℃保存
6．脫片問題： Poly-L-Lysine（多聚賴氨酸）為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑,6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理.如不行,可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片.在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法：切片在脫蠟前,放在APES 1：50 丙 酮溶液中浸泡3分鐘,晾干,即可進行下一步.
7．滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活.
8．暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實驗時,必須采用高溫加熱抗原修復,這將有助于暴露抗原決定簇,從而增加免疫組化染色的強度（不同抗體的*修復液請參閱抗體說明書）.對于不同的組織,不同的抗原,不同的抗體,所采用的方法應(yīng)不一樣,可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化.膠原還可以用胃蛋白酶消化等.
9．封閉：在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強時,可延長封閉時間或用濃縮血清封閉
10．抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則,對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用.
11．背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特別是在顯色之前要多洗.
12．返藍：在蘇木素復染后,可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍.
13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察,注意控制背景.

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