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MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖正確操作步驟
更新時(shí)間：2021-02-03 瀏覽次數(shù)：3483
一、實(shí)驗(yàn)方法原理
MTT 分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑 3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT 噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)。MTT 為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環(huán)開裂，藍(lán)色的 formazan 結(jié)晶，formazan 結(jié)晶的量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原）。還原的 formazan 結(jié)晶可在含 50% 的 N，N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的 MTT 溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的光密度 OD 值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用 DMSO 來溶解。
二、實(shí)驗(yàn)材料
1.細(xì)胞樣品
2.試劑、試劑盒：10% 胎小牛血清 MTT 溶液 DMSO
3.儀器、耗材：96 孔板 離心機(jī) 酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1.接種細(xì)胞
用含 10% 胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔 1000－10000 個(gè)細(xì)胞接種到 96 孔板，每孔體積 200ul。
2.培養(yǎng)細(xì)胞
同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng) 3－5 天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。
3.呈色
培養(yǎng) 3－5 天后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 配）20ul. 繼續(xù)孵育 4 小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加 150ul DMSO，振蕩 10 分鐘，使結(jié)晶物充分融解。
4.比色
選擇 490nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
