神經(jīng)干細胞與血管性癡呆大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元變化的相關性
孫玉華，耿利嬌，趙靜雅，賀維亞，李保平(河南大學淮河醫(yī)院神經(jīng)內科，河南省開封市 475001) 

文章亮點：
1 有研究顯示，神經(jīng)干細胞移植可以增加血管性癡呆模型大鼠腦內膽堿能神經(jīng)細胞，其機制可能為外源性神經(jīng)干細胞在移植區(qū)增殖、分化，并可能促進了內源性神經(jīng)干細胞的分化、遷移，改善了大鼠腦內局部的微環(huán)境。
2 神經(jīng)干細胞移植后膽堿乙酰轉移酶陽性細胞增多，從而有效促進膽堿能神經(jīng)元分化及生長，乙酰膽堿增多，使大鼠海馬區(qū)神經(jīng)功能恢復，并促進大鼠學習記憶能力的有效改善，其具體機制目前尚缺乏有利證據(jù)支持。
關鍵詞：
干細胞；移植；癡呆；血管性；海馬膽堿能神經(jīng)元；神經(jīng)干細胞；干細胞移植；膽堿乙酰轉移酶；學習記憶能力；乙酰膽堿；SD 大鼠
主題詞：
神經(jīng)干細胞；癡呆, 血管性；神經(jīng)元；組織工程
摘要
背景：血管性癡呆患者存在額葉皮質及海馬膽堿能神經(jīng)元受損，可能是導致患者認知功能受損的形態(tài)學基礎。
目的：探討神經(jīng)干細胞與血管性癡呆大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元變化的相關性。
方法：納入 90 只 SD 大鼠，隨機均分為 3 組，其中假手術組僅分離頸總動脈，模型組和神經(jīng)干細胞移植組采用兩血管結扎法建立血管性癡呆動物模型，神經(jīng)干細胞移植組在建立血管性癡呆動物模型之后向大鼠海馬CA1 區(qū)注射 5 μL 神經(jīng)干細胞，另外兩組按照同樣的操作注射相同劑量的生理鹽水。移植后第 3，7，14，30，60 天，分別處死各組 6 只大鼠，采用 S-P 免疫組化法檢測各組腦實質 BrdU 陽性細胞和 ChAT 陽性細胞分布情況，利用 Morris 水迷宮系統(tǒng)檢測大鼠學習記憶能力。
結果與結論：BrdU 陽性細胞主要分布在大腦皮質區(qū)以及海馬區(qū)，尤其是血管周圍。在基底核和丘腦以及室管膜區(qū)，可觀察到少量 BrdU 陽性細胞存在。隨著時間的推移，BrdU 陽性細胞數(shù)目不斷下降，到移植后 60 d，僅存在少量 BrdU 陽性細胞存活。移植后不同時間模型組和神經(jīng)干細胞移植組的 ChAT 陽性細胞數(shù)均顯著大于假手術組(P < 0.05)；模型組 ChAT 陽性細胞數(shù)顯著低于神經(jīng)干細胞移植組(P < 0.05)。模型組尋找平臺時間顯著長于假手術組，穿越平臺次數(shù)顯著少于假手術組(P < 0.05)；神經(jīng)干細胞移植組的尋找平臺時間顯著短于模型組，穿越平臺次數(shù)顯著大于模型組(P < 0.05)。結果表明神經(jīng)干細胞可以在大鼠腦內存活并發(fā)生遷移，顯著改善血管性癡呆大鼠學習記憶能力，相關機制可能與海馬膽堿能神經(jīng)元分化和生長有關。

引言 Introduction
隨著社會發(fā)展和人口的老齡化，各種腦血管病的發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢[1]。血管性癡呆是一種由腦血管疾病所致的認知功能障礙綜合征，嚴重影響患者和家屬的生活質量，也給整個社會以及家庭帶來了沉重的精神和經(jīng)濟負擔[2]。血管性癡呆的病情發(fā)展十分迅速，在病史中有反復多次的腦卒中發(fā)作，腦卒中每發(fā)作1次癡呆癥狀加重1次[3]。按照病理形態(tài)可將血管性癡呆分為彌漫性缺血型、多發(fā)性梗死型和重要部位的梗死型，如海馬回、丘腦及額葉的梗死。血管性癡呆會導致乙酰膽堿合成量和膽堿乙酰轉移酶活性顯著下降[4]。1992年，國外學者Reynolds等[5]從成年大鼠紋狀體和海馬中分離出一種特殊的細胞群，這類細胞群能自我更新并具有多向分化潛能。隨著干細胞理論和相關研究的不斷進展，確定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在神經(jīng)干細胞。大量研究發(fā)現(xiàn)，各種原因導致神經(jīng)細胞損傷后，可以利用一定的方式進行修復，以達到治療疾病的目的，其中神經(jīng)干細胞移植治療是一個重要的途徑[6-7]。本研究建立血管性癡呆動物模型并進行神經(jīng)干細胞移植，通過觀察腦實質BrdU陽性細胞和ChAT陽性細胞分布情況以及大鼠學習記憶能力，探討神經(jīng)干細胞與血管性癡呆大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元變化的相關性。
1 材料和方法 Materials and methods 
1.1 設計 隨機對照動物實驗。
1.2 時間及地點 實驗于2015年4至7月在河南大學淮河醫(yī)院完成。
1.3 實驗動物和材料 90只成年雌性SD大鼠，體質量180-220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，使用許可證號：scxk(滬)2015-0015。5只新生1-3 d SD大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學要求。
1.4 實驗方法
1.4.1 動物分組與血管性癡呆大鼠模型制作 將90只成年SD大鼠隨機分為3組，其中模型組30只，神經(jīng)干細胞移植組30只，假手術組30只。模型組和神經(jīng)干細胞移植組均采用兩血管結扎法建立血管性癡呆動物模型。大鼠常規(guī)禁食 12 h、禁水4 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，于頸前部皮膚正中做切口，鈍性分離雙側頸總動脈，利用“1”號線對兩側頸總動脈進行結扎，結扎后常規(guī)消毒，縫合皮膚。假手術組實施相同的分離操作，僅分離雙側頸總動脈，不結扎。

神經(jīng)干細胞移植后血管性癡呆大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元變化的實驗所用主要試劑與儀器：

 試劑與儀器 來源 
乙醇 上海樊克生物科技有限公司
胰蛋白酶 上海弘順生物科技有限公司
胎牛血清 北京普博斯生物科技有限公司
移液槍 上海靜融生物科技有限公司
青霉素 上海勝邁醫(yī)療器械有限公司
磷酸鹽緩沖液 上海瑞楚生物科技有限公司
鏈霉素 上海勁馬實驗設備有限公司
DMEM培養(yǎng)基 百浩生物科技有限公司(北京) 
兔抗大鼠ChAT多克隆抗體 上海古朵生物科技有限公司
鼠抗人BrdU抗體 上海拜力生物科技有限公司
兔抗鼠熒光二抗 中國北京中杉金橋生物技術公司
二抗免疫組化試劑盒(SP試劑盒) 北京博奧森生物技術有限公司
DAB顯色試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司
流式細胞儀 金華市科迪儀器設備有限公司
離心機 上海明茲精密儀器有限公司

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