上海“勁馬”蛋白質相對分子質量的測定

一、實驗原理

蛋白質在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質比例的SDS-蛋白質多肽復合物，該復合物帶負電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質的分子量大小有關，因此可以濃縮和分離蛋白質多肽。

聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質多數采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強度也相應不同，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復合物沿移動的界面移動，在分離膠表面形成了一個極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應。

二、儀器及器材

垂直電泳槽及附件、直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、移液器等。

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三、試劑

1、凝膠貯備液：稱取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 甲叉-雙丙烯酰胺（Bis），蒸餾水溶解后定容至100mL，濾紙過濾貯存。

2、10% SDS：稱取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。

3、10%過硫酸胺（AP），用時現配。

4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）。

5、電極緩沖液：3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水，混勻后用HCL調節(jié)pH至8.3，加蒸餾水至1 000ml。

6、樣品溶解（緩沖）液：0.6gTris、5mL甘油（丙三醇）1.0g SDS溶于水，混勻后用HCL調節(jié)pH至8.0，再加0.1g溴酚藍、2.5mL巰基乙醇，定容至100mL。

7、下層膠（分離膠）緩沖液：18.17g Tris、0.4gSDS溶于水，混勻后用1mol/L HCL調節(jié)pH至8.8，加蒸餾水至100ml。

8、上層膠（濃縮膠）緩沖液：6.06g Tris、0.4gSDS溶于水，混勻后用1mol/L HCL調節(jié)pH至6.8，加蒸餾水至100ml。

9、固定液：25%異丙醇，10%乙酸。

10、染色液：0.125g考馬斯亮藍R-250加固定液250ml。

11、脫色液：冰乙酸75ml、甲醇50ml，加水定容至1000ml。

12、1.5%瓊脂：1.5g瓊脂溶于100mL電極緩沖液中，加熱溶解。

13、標準相對分子質量蛋白質。

四、操作步驟

1、電泳槽的安裝

干燥的兩塊玻璃板裝入配套塑料夾套內，垂直固定在電泳槽上，周邊用1.5%的瓊脂密封。

2、樣品的制備

稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內，加入1mL去離子水研磨成勻漿，轉入離心管中，再加入2mL去離子水沖洗研缽，3500r/min離心20min，上清液備用。

將標準蛋白質和待測樣品分別溶于樣品溶解液，在沸水中加熱3-4min，待冷卻后作點樣用。

3、制膠

選擇合適的膠濃度（表1），配制分離膠，混合后將其沿長玻璃板加入兩塊玻璃板之間（小心不要產生氣泡），加到距短玻璃板上邊緣3cm處，立即覆蓋2-3mm水層，靜止聚合約40min左右。膠聚合好的標志是膠與水之間形成清晰的界面。

吸取分離膠的水分，將配好的濃縮膠（表1）注入分離膠之上，立即插上有機玻璃的點樣槽模板，待濃縮膠聚合好備用。

表1 不同濃度凝膠體系

4、點樣

用移液器分別吸取標準蛋白質5μL和樣品液20μL，注入樣品槽內的濃縮膠上面，同時在樣品上小心地注入電極緩沖液。

5、電泳

加樣完畢，電泳槽內注入適量電極緩沖液，接通電源（上負下正），調節(jié)電流為15mA，當指示劑進入分離膠后，電流需加大到30mA，電壓恒定在80-100V，約3-4h后，指示劑達到距離前沿1-2cm時，可終止電泳。

6、固定

膠取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后將膠浸泡在25%異丙醇和10%乙酸的混合液中1h，蛋白質就會到固定。

7、染色

取出凝膠板，加入染色液染色2h。

8、脫色

將膠放在脫色液中脫色0.5h，每隔0.5h換一次脫色液，至少換3次，待藍色基本脫掉，再放在脫色液里浸泡至蛋白質譜帶清晰為止。

9、照相。

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