結(jié)合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中至關(guān)重要的關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原），此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

用于ELISA的酶應符合以下要求：

①純度高

②催化反應的轉(zhuǎn)化率高

③專一性強

④性質(zhì)穩(wěn)定

⑤來源豐富

⑥價格不貴

⑦制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保存它的活性部分和催化能力

⑧在受檢標本中不存在相同的酶

⑨相應底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等

在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無色糖蛋白在275nm波優(yōu)點有高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波優(yōu)點有高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥7.0。

HRP除符合上述的ELISA中標記酶的要求外，更有價格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點。值得留意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應留意酶的活力。高純度的酶如保存不當，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后天生產(chǎn)物量的測定進行試驗。

國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶。常用的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，適宜pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空缺值也較低，但AP價格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。

制備結(jié)合物時所用抗體一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾。用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結(jié)果本底淺淡。如用F(ab)2進行標記，則更可避免標本中RF的干擾。在ELISA中用酶標抗原的模式未幾，總的要求是抗原必須是高純度的。

用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加進高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加進具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋后進行測定，也可應用這種稀釋液。